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軟骨寡聚基質(zhì)蛋白(COMP)誘導(dǎo)C57BL/6的小鼠關(guān)節(jié)炎造模方案

更新時(shí)間:2023-12-22點(diǎn)擊次數(shù):443

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Vacara是一家瑞典公司,致力于開(kāi)發(fā)新型類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎診斷試劑盒、創(chuàng)新的預(yù)防和治療方法。產(chǎn)品包括:診斷試劑盒、疫苗研究產(chǎn)品、保護(hù)性抗體以及人源化動(dòng)物模型和用于誘導(dǎo)設(shè)計(jì)的免疫反應(yīng)和誘導(dǎo)T細(xì)胞介導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎的抗原(Cag1、Cag2、Cag3、Cag4、Cag5)。


軟骨寡聚基質(zhì)蛋白(COMP)誘導(dǎo)C57BL/6的小鼠關(guān)節(jié)炎造模方案

背景簡(jiǎn)介:

轉(zhuǎn)基因小鼠研究常用的品系是C57BL/6遺傳背景小鼠,由于缺乏該品系的類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)可靠模型而限制了該品系在風(fēng)濕病研究中的的應(yīng)用。膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(CIA)是廣泛的類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型,而C57BL/6小鼠由于具有MHC II類(lèi)單倍型H-2b,其不能有效用于制備膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(CIA)模型。

瑞典Vacara公司開(kāi)發(fā)了一種用軟骨寡聚基質(zhì)蛋白(COMP)誘導(dǎo)C57BL/6小鼠關(guān)節(jié)炎模型。該蛋能夠在C57BL/6小鼠誘導(dǎo)高發(fā)病率的嚴(yán)重關(guān)節(jié)炎,并伴有強(qiáng)烈的自身抗體反應(yīng)。

關(guān)鍵詞:瑞典Vacara,類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、軟骨寡聚基質(zhì)蛋白(COMP)、Cartilage Oligomeric Matrix Protein、C57BL/6小鼠,轉(zhuǎn)基因

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:

COMP誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎可以在雄性和雌性小鼠中都可以進(jìn)行。如果使用雌性小鼠,應(yīng)該講它們放在一起一段時(shí)間,以同步它們的發(fā)情周期。如果使用雄性小鼠,特別重要的一點(diǎn)是在性成熟之前將其分組以避免相互攻擊。

在實(shí)驗(yàn)中,所有小鼠必須年齡和性別匹配,隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組,實(shí)驗(yàn)組混合在在籠中。用于造模的小鼠至少要9周齡。小鼠在標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)條件下飼養(yǎng),優(yōu)先選擇SPF飼養(yǎng)設(shè)施,該設(shè)施具有12小時(shí)明暗循環(huán)的氣候控制環(huán)境,飼養(yǎng)在具有標(biāo)準(zhǔn)食物和隨意給水的籠中。實(shí)驗(yàn)也在傳統(tǒng)動(dòng)物房進(jìn)行,但是所有的可變條件(感染、通風(fēng)、光循環(huán)、喂養(yǎng)等)都需要詳細(xì)描述,因?yàn)檫@些條件變化可能會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

模型誘導(dǎo)方案:

關(guān)節(jié)炎模型通過(guò)COMP 免疫小鼠誘導(dǎo)。將COMP100ug/小鼠)與佐劑(CFA, #263810, BD Difco)或含有結(jié)核桿菌(0.5mg/ml)的CFA 1:1 等體積混合制備乳劑。制備乳劑最終100ul乳劑中含COMP 100ug。

初次免疫(0天)

每只小鼠尾根部皮內(nèi)免疫100ul 乳劑(COMPCFA(0.5mg/ml)配置的乳劑,含100ug COMP

加強(qiáng)免疫(35天)

每只小鼠尾根部皮內(nèi)免疫50ul乳劑(COMPIFA)配置的乳劑,含50ug COMP





初次免疫佐劑選擇(CFAIFA)可能會(huì)影響疾病的嚴(yán)重程度。相對(duì)含有結(jié)核桿菌的(Mycobacterium Tuberculosis H37RaIFA,CFA2mg/ml M.butyricum)會(huì)導(dǎo)致更嚴(yán)重的炎癥。

不管初次免疫的佐劑如何選擇,預(yù)計(jì)的發(fā)病時(shí)間都是相同的。加強(qiáng)免疫后預(yù)計(jì)出現(xiàn)更嚴(yán)重的炎癥(見(jiàn)圖1)。環(huán)境因素如小鼠的微生物菌群變化,可能會(huì)影響疾病的嚴(yán)重程度,可以通過(guò)選擇適合環(huán)境和實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡淖魟﹣?lái)控制。

關(guān)節(jié)炎評(píng)分:

初次免疫2周開(kāi)始,每周至少對(duì)小鼠進(jìn)行三次外周關(guān)節(jié)炎癥查看。對(duì)爪子關(guān)節(jié)炎的癥狀隨機(jī)觀察,對(duì)每個(gè)紅腫關(guān)節(jié)進(jìn)行盲評(píng)分。要定義為臨床關(guān)節(jié)炎,必須滿足兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn),即腫脹和發(fā)紅。因此,例如在活動(dòng)性關(guān)節(jié)炎后仍然腫脹但不載觀察到紅斑的爪子不被評(píng)分或不認(rèn)為是關(guān)節(jié)炎。

臨床關(guān)節(jié)炎的評(píng)分結(jié)果是0-60分:根據(jù)關(guān)節(jié)炎疾病的嚴(yán)重程度,每只發(fā)炎的足趾或關(guān)節(jié)得1分,腳腕或腳踝發(fā)炎得1-5分,每只爪子得0-15分,每只小鼠最多得60分。典型的嚴(yán)重過(guò)程如圖1.所示。

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1 COMP誘導(dǎo)C57BL/6小鼠具有高發(fā)病率和嚴(yán)重程度的關(guān)節(jié)炎。小鼠用COMP+CFA佐劑(n=7)或IFA+0.5mg/ml結(jié)核桿菌(n=6)免疫,第35天加強(qiáng)免疫。關(guān)節(jié)炎發(fā)病率(左側(cè))和關(guān)節(jié)炎評(píng)分(右側(cè))。

COMP誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎特征:

與人關(guān)節(jié)炎相似,COMP誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)中顯著的滑膜增生、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及軟骨和骨破壞。COMP誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎導(dǎo)致顯著的抗COMP  IgG, IgG1,IgG2b自身抗體反應(yīng),與初次免疫使用的佐劑無(wú)關(guān)。在C57BL/6小鼠中,未觀察到顯著的抗II型膠原抗體反應(yīng),這表明COMP特異性B細(xì)胞反應(yīng)。COMP反應(yīng)似乎是肽特異性的,因?yàn)楹苌儆须谋徽J(rèn)為主要的自身抗體表位。

COMP僅以天然構(gòu)象誘導(dǎo)嚴(yán)重的臨床關(guān)節(jié)炎。變性的COMP免疫,只能導(dǎo)致輕微的關(guān)節(jié)炎,發(fā)病率低。然而,這良好總構(gòu)象都誘導(dǎo)抗COMP抗體反應(yīng),但當(dāng)天然COMP用于免疫時(shí),觀察到更強(qiáng)的抗COMP IgG、IgG1IgG2b抗體反應(yīng)。結(jié)論是:構(gòu)象表位的抗體是致病性的,可以誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎,并且這些抗體可能是由COMP特異性細(xì)胞協(xié)助激發(fā)的。

檢測(cè)方法:

關(guān)節(jié)炎發(fā)生后,可以在蘇木精和伊紅染色后對(duì)關(guān)節(jié)炎急性組織學(xué)分析???/span>COMP的血清抗體可以通過(guò)ELISA法測(cè)定,使用重組人COMP作為測(cè)定抗原。操作流程,用于檢測(cè)IgG,IgG1IgG2b系列抗體及在C57BL/6小鼠典型結(jié)果在文獻(xiàn)3種有詳細(xì)描述。肽特異性T細(xì)胞活化可通過(guò)體外刺激脾細(xì)胞并通過(guò)ELISpot測(cè)定IFN-γ 分泌來(lái)測(cè)量,如文獻(xiàn)3所述。

優(yōu)勢(shì):

COMPC57BL/6小鼠中誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎與類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎小鼠模型CIA有許多相似之處,能夠誘發(fā)嚴(yán)重的多發(fā)性關(guān)節(jié)炎。該炎癥于MHCII類(lèi)分子相關(guān),T細(xì)胞識(shí)別的COMP衍生肽已被證實(shí)。與CIA一樣,T細(xì)胞對(duì)非自身蛋白抗原的反應(yīng)促進(jìn)了關(guān)節(jié)炎的誘導(dǎo),因?yàn)槊庖邇?yōu)勢(shì)肽不能很好的與MHC II類(lèi)分子結(jié)合,因此不能誘導(dǎo)耐受性。COMP免疫誘導(dǎo)強(qiáng)烈的抗體反應(yīng),類(lèi)似CIA中的II型膠原。

COMP誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎的主要優(yōu)點(diǎn)是:可以在攜帶H-2b單倍型的C57BL/6小鼠中誘導(dǎo)嚴(yán)重的關(guān)節(jié)炎。C57BL/6小鼠被認(rèn)為是免疫學(xué)研究的標(biāo)準(zhǔn)背景,并且大多數(shù)轉(zhuǎn)基因小鼠株都是在這個(gè)背景下建立的。對(duì)于COMP誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎,遺傳修飾的C57BL/6小鼠可用于關(guān)節(jié)炎實(shí)驗(yàn),而無(wú)需廣泛的回交。

COMP也可以誘導(dǎo)C3H背景表達(dá)Aq, Ap小鼠。因此,COMP誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎在許多小鼠品系中可用于研究關(guān)節(jié)炎,并且免疫反應(yīng)與人類(lèi)RA直接相當(dāng)。COMP誘導(dǎo)的小鼠關(guān)節(jié)炎在雌性和雄性中都是可誘導(dǎo)的。此外,COMP可以誘導(dǎo)大鼠關(guān)節(jié)炎,與LEW,E3 DA 背景的RT1u MHC單倍型相關(guān)。

局限性:

 COMP誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎在加強(qiáng)免疫后會(huì)誘發(fā)嚴(yán)重的關(guān)節(jié)炎,因此需要幾周的時(shí)間來(lái)實(shí)驗(yàn)。另一方面,這種特征被認(rèn)為是一種優(yōu)勢(shì),因?yàn)樵摷膊∧P团c人類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎具有相同的免疫特征和T細(xì)胞和B細(xì)胞依賴(lài)性機(jī)制。

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產(chǎn)品名稱(chēng)

規(guī)格

Vacara

Native Cartilage   Oligomeric Matrix Protein, recombinant human (rhCOMP)

10020

1mg



參考文獻(xiàn)

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