關鍵詞：顯微鏡檢查,熒光/方法;巨噬細胞/生理學；鈣/分析；酸堿平衡；小鼠

　　摘　要　目的　細胞內游離Ca²⁺與胞漿的pH在不同因素作用下可以改變。研究可以同時檢測游離Ca²⁺與pH變化的方法激光掃描共聚焦顯微鏡觀察。方法　用胞內游離Ca²⁺和pH熒光探針

　　fluo-3/AM和SNARF-1/AM標記小鼠腹腔巨噬細胞后，在激光掃描共聚焦顯微鏡（ACAS570）下，同時用zui適發(fā)射波長分別為530 nm和大于605 nm的檢測器1和檢測器2檢測巨噬細胞內fluo-3/AM和SNARF-1/AM的熒光強度變化。結果　檢測器1和檢測器2分別只檢測反映細胞內游離Ca²⁺和

　　pH變化的fluo-3/AM和SNARF-1/AM所發(fā)熒光的變化；SNARF-1/AM和fluo-3/AM所發(fā)熒光相互不影響。結論　激光掃描共聚焦顯微鏡可同時檢測細胞內游離Ca²⁺和pH的變化。

　　中圖號　R329.3

　　Simultaneous Detection of Free Cytosolic Calcium and Intracellular pH by Laser Scanning ConfocalHuang Xingxu, BaoYongyao, Huang Hui, et al.Central laboratory, First Military Medical 510515

　　microscope

　　university,

　　Abstract　Objective　Free cytosolic calcium and intracellular pH can have some changes due to certain

　　factors.It is to explore a method for simultaneous detection on the changes,that is,observation with laser scanning

　　confocal microscope.Methods　Ca²⁺-and pH-sensitive fluorescence probes of fluo-3/AM and SNARF-1/AM

　　were used to mark the peritoneal macrophages simultaneously. Then, the variations of the fluorescence were

　　detected with detector 1 （optimum emission wavelength: 530nm） and detector 2（optimum emission wavelength:＞605nm） of the laser scanning confocal microscope （ACAS570）.Results　Detector1 and 2 each detected the

　　variations of the fluorescence of fluo-3/Am or SNARF-1/AM of the Ca²⁺ or pH. The fluorescence of fluo-3/AM

　　and SNARF-1/AM did not influence each other. And the forms of the alteration in free cytosolic calcium and

　　intracellular pH of the macrophages varied when they were stimulated by different stimulators.Conclusion　Laser

　　scanning confocal microscope could be used in simultaneous detection of free cytosolic calcium and intracellular

　　pH.

　　Key words　microscopy,fluorescence/methods;macrophages/physiol;calcium/anal;acid-base equilibrium;

　　mice

　　細胞受各種因素作用時，胞內Ca²⁺和pH發(fā)生變化^〔1〕，不過由于缺乏能同時檢測胞內Ca²⁺和

　　pH動態(tài)變化的方法，二者之間的關系仍不很清楚。近年來，隨著激光掃描共聚焦顯微鏡技術和熒光探針的開發(fā)利用^〔2〕，新一代的胞內游離Ca²⁺和pH熒光探針fluo-3/AM和SNARF-1/AM被分別用于胞內游離Ca²⁺和pH變化的檢測^〔3,4〕。根據fluo-3/AM和胞內游離Ca²⁺結合后在波長530 nm處熒光強度隨游離Ca²⁺濃度升高而增強，而SNARF-1/AM的熒光強度在波長＞605 nm時隨胞內pH升高而增強，它們的激發(fā)波長均為480 nm^〔5,6〕以及fluo-3/AM的熒光強度不受SNARF-1/AM影響^〔3〕等特點，我們設計了本實驗，擬利用fluo-3/AM和SNARF-1/AM混合物同時著染巨噬細胞，以觀察巨噬細胞內游離Ca²⁺和pH的動態(tài)變化。

材 料 和 方 法

　　一、主要材料

　　帶雙檢測器的激光掃描共聚焦顯微鏡（ACAS570），美國Meridian公司生產。fluo-3/AM、

　　sNARF-1/AM，美國Molecular probes Inc產品。RPMI－1640、Hepes購于Sigma公司。小牛血清，浙江杭州四青生物材料廠制品。其它試劑均為分析純。

　　二、細胞培養(yǎng)

　　體重20 g左右雌性正常昆明小鼠，按照鄂征等人的方法^〔7〕取腹腔巨噬細胞，以5×10⁵個/cm²的濃度接種于改裝35 mm Petri細胞培養(yǎng)皿底部的蓋玻片上，用含10％小牛血清的RPMI－1640培養(yǎng)于37^oC含5％CO₂的孵育箱內。

　　三、熒光探針標記

　　吸除培養(yǎng)皿內的培養(yǎng)液，用Hepes緩沖鹽溶液洗三次，分別在不同培養(yǎng)皿中滴入10μmol/L

　　fluo-3/AM、10μmol/L sNARF-1/AM和含10μmol/L fluo-3/AM和10μmol/L sNARF-1/AM的混合液0.3 ml，37^oC孵育30～60分鐘，吸除染液，用Hepes緩沖鹽溶液洗3次，再加入0.5 ml Hepes緩沖鹽溶液。

　　四、ACAS570檢測胞內Ca²⁺和pH

　　將培養(yǎng)皿置于ACAS570載物臺上，選用40×物鏡，7％濾光片，確定激發(fā)光波長為488 nm，進入Ratio－Generic－Image scan程序，打開檢測器1（zui適發(fā)射波長530 nm）和檢測器2（zui適發(fā)射波長大于605 nm），建立文件，作預掃描后選定*掃描參數，對選定視野掃描并存儲所獲信息。主要掃描參數如下：Pinhole1 600μm, pMT1 70%, PMT2 70%, Scanning Strength 20%, Laser

　　power 10 mW。

　　五、單檢Ca²⁺或pH時按張薇等人的方法^〔4〕，分別打開檢測器1或2進行。

　　六、分析

　　雙檢分析進入Ratio－Generic－Image analysis程序，調入分析文件，得出同時反映細胞內Ca²⁺和pH動態(tài)變化的熒光強度變化曲線。單檢分析進入Kinetics－Image－Analysis程序，分別調入分析文件，得出各自反映細胞內Ca²⁺或pH動態(tài)變化的熒光強度變化曲線。

結 果

　　一、細胞熒光圖像

　　圖1和圖2分別為檢測器1和檢測器2同時打開時檢測到的fluo-3/AM和SNARF-1/AM的細胞熒光圖像。圖1顯示僅檢測器1檢測到fluo-3/AM所發(fā)熒光，同樣，圖2顯示僅檢測器2檢測到SNARF-1/AM所發(fā)熒光。

　　二、單測巨噬細胞內Ca²⁺和pH的變化

　　單檢結果顯示，小鼠巨噬細胞未受到刺激時，fluo-3/AM和SNARF-1/AM熒光強度不變，巨噬細胞內的Ca²⁺和pH穩(wěn)定；加入維拉帕米（終濃度1μmol/L）后200 sec，fluo-3/AM的熒光強度下降了0.45，SNARF-1/AM的熒光強度下降了0.2；加入腎上腺素（終濃度1μmol/L）后200 sec，

　　fluo-3/AM的熒光強度上升0.35，SNARF-1/AM熒光強度下降0.2。

　　三、雙測巨噬細胞內Ca²⁺和pH的變化

　　雙檢結果顯示，顯示小鼠巨噬細胞未受到刺激時，fluo-3/AM和SNARF-1/AM熒光強度同樣不變。加入維拉帕米（終濃度1μmol/L）后200 sec，fluo-3/AM的熒光強度下降了0.42，SNARF-1/AM的熒光強度下降了0.22（圖3）；加入腎上腺素（終濃度1×10μmol/L）后200 s，fluo-3/AM的熒光強度上升0.36，SNARF-1/AM熒光強度下降0.21（圖4）。

　　圖3 歸一化維拉帕米（1μmol/L）處理巨噬細胞內fluo-3/AM和SNARF-1/AM熒光強度變化曲線圖,檢測器1表示fluo-3/AM的熒光強度變化,檢測器2表示SNARF-1/AM的熒光強度變化,標記示加樣時間圖4 歸一化腎上腺素（1μmol/L）處理巨噬細胞內fluo-3/AM和SNARF-1/AM熒光強度變化曲線圖,檢測器1表示fluo-3/AM的熒光強度變化,檢測器2表示SNARF-1/AM的熒光強度變化,標記示加樣時間

　　圖1　細胞內游離鈣特異性熒光屏　flou-3/AM熒光圖，檢測器1可檢測到fluo-3/AM的熒光，但

　　幾乎未檢測到任何SHARF-1/AM的熒光圖2　細胞胞漿_PH特異性熒光探針SNARF-1/AM的熒光圖，檢測器2可檢測到SNARF-1/AM的熒光，

　　但幾乎未檢測到任何flou-3/AM的熒光

討 論

　　檢測器1和檢測器2只檢測到fluo-3/AM和SNARF-1/AM的細胞熒光圖像，表明檢測器1和檢測器2均有較嚴格的zui適發(fā)射波長，適合同時檢測波長不同，特別是波長相差較大的熒光。而且，經維拉帕米和腎上腺素作用后，單檢和雙檢結果顯示fluo-3/AM的熒光強度變化和SNARF-1/AM的熒光強度變化均基本一致。這不僅證實了fluo-3/AM的熒光強度不受SNARF-1/AM影響^〔3〕，也反映出SNARF-1/AM的熒光強度不受fluo-3/AM影響。這些，肯定了在激光掃描共聚焦顯微鏡下可用熒光探針fluo-3/AM和SNARF-1/AM同時檢測活細胞內游離Ca²⁺和胞漿pH的動態(tài)變化，從而為探討細胞內游離Ca²⁺和胞漿pH之間的關系創(chuàng)造了條件。

　　實驗結果表明,新近開發(fā)的激光掃描共聚焦顯微鏡技術不僅可作原位實時動態(tài)檢測,具有實驗過程快速, 樣品處理簡便, 得到數據全面等優(yōu)點^〔2〕。還能顯示單個細胞的熒光強度變化，將檢測提高到單細胞水平。而且由于共焦鏡法實現了對活細胞熒光強度變化的連續(xù)追蹤，因而可準確反映細胞在加樣瞬間的變化。

　　細胞內游離Ca²⁺和胞漿pH均與細胞功能相關^〔8〕。心肌細胞內游離Ca²⁺升高伴隨胞漿酸化^〔9〕。

　　對巨噬細胞游離Ca²⁺及胞漿pH關系的初步研究結果顯示，盡管經腎上腺素處理,巨噬細胞游離Ca²⁺及胞漿pH的變化和心肌細胞相似。但經維拉帕米作用后，巨噬細胞胞漿pH和游離Ca²⁺均降低。這表明巨噬細胞胞漿pH變化并不象心肌細胞一樣由細胞內游離Ca²⁺升高引起。巨噬細胞內游離Ca²⁺和胞漿pH之間的確切關系仍需進一步探討。

　　參 考 文 獻

　　1 Hayashi H, Miyata H, Noda N, et al. Intracellular Ca²⁺ concentration and pH_i during metabolic inhibition.

　　am J Physiol, 1992, 262C:635-643.

　　2 Davin MS. Confocal scanning optical microscopy and its applications for biological specimens. J Cell Science,

　　1989, 94（2）:175-206.

　　3 Rijkers GT, Justement LB, Griffioen AW, et al. Improved method for measuring intracellular Ca²⁺ with fluo-3.

　　cytometry, 1990, 11: 923-927.

　　4 張薇，樸英杰，鮑永耀，等.粘附式細胞儀測定巨噬細胞內游離鈣的方法.*軍醫(yī)大學學報，

　　1994, 14（1）：43-45.

　　5 Seksek O, Henry Toulme N, Sureau f, et al. SNARF-1 as an intracellular pH indicator in laser

　　microspectrofluorometry: A critical assessment. Anal Biochem, 1991, 193: 49-54.

　　6 Richard PH, Molecular Probe. Handbook of fluorescent probes and research chemicals, 5th Edition, USA,

　　1994:223-224.

　　7 鄂征主編.組織培養(yǎng)技術.北京：人民衛(wèi)生出版社，1993:185-187.

　　8 Wray S. Smooth muscle intracellular pH: Measurement, regulation, and function. Am J Physiol,

　　1988, 254C:213-225.

　　9 Daugirdas JT, Arrieta J, Ye MH, et al. Intracellular acidification associated with changes in free cytosolic