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可溶性凋亡基因sCD95（APO1/Fas） ELISA 試劑盒
更新時(shí)間：2013-06-19
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sCD95（APO1/Fas） ELISA 試劑盒
用途：
人sCD95 ELISA 試劑盒用于體外定量檢測(cè)人血清、血漿、緩沖液或細(xì)胞培養(yǎng)液中的可溶性
CD95（APO-1, Fas）。本實(shí)驗(yàn)可以檢測(cè)天然的和重組的sCD95。本試劑盒于研究，而非
用于診斷。
試驗(yàn)原理：
sCD95 試劑盒是固相夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）?？箂CD95 特異單克隆抗體包被
微孔板，已知sCD95 濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣本、對(duì)照樣本和未知樣本加入微孔進(jìn)行檢測(cè)。
先將sCD95 抗原和生物素標(biāo)記的抗sCD95 特異單克隆抗體同時(shí)孵育。洗滌后，加入親和
素過(guò)氧化物酶。再經(jīng)過(guò)孵育和洗滌，去除未結(jié)合的酶，然后加入酶復(fù)合物的作用底物，產(chǎn)生
顏色反應(yīng)。顏色的深淺和樣本中sCD95 的濃度呈比例關(guān)系。
提供的試劑和配制方法：
| 試劑（2~8℃保存） | 數(shù)量 | 色標(biāo) | 配制 |
| 96 微孔板 | 1 | | 即用型 |
| 塑料蓋板 | 2 | | |
| 標(biāo)準(zhǔn)品：3000pg/ml | 2 支凍干粉 | 黃色 | 按標(biāo)簽要求以標(biāo)準(zhǔn)稀釋液稀釋 |
| 對(duì)照 | 2 支 | 銀色 | 按標(biāo)簽要求以標(biāo)準(zhǔn)稀釋液稀釋 |
| 標(biāo)準(zhǔn)稀釋緩沖液 | 1 支（25ml） | 黑色 | 10X, 用蒸餾水稀釋 |
| 生物素標(biāo)記抗sCD95 | 1 支（0.4ml） | 紅色 | 用生物素標(biāo)記抗體稀釋液稀釋 |
| 生物素標(biāo)記抗體稀釋液 | 1 支（13ml） | 紅色 | 即用型 |
| 親和素HRP | 2 支（5ul） | | 0.5mlHRP 稀釋液預(yù)稀釋 |
| HRP 稀釋液 | 1 支（23ml） | 紅色 | 即用型 |
| 洗滌液 | 1 支（10ml） | 白色 | 200X, 用蒸餾水稀釋 |
| TMB | 1 支（24ml） | | 即用型 |
| 硫酸終止液 | 1 支（11ml） | 黑色 | 即用型 |
試驗(yàn)需要但未提供的用品：
?? 蒸餾水
?? 微量加樣器：10ul,50ul,100ul,200ul,1000ul
?? 旋渦振蕩器和磁力攪拌器
安全性：
?? 僅用于科研
?? 本試驗(yàn)所用的人血成分均經(jīng)檢測(cè)，不含有HbsAg 和抗HIV 陽(yáng)性物質(zhì)。盡管如此，無(wú)法
確保沒(méi)有傳播肝炎或艾滋病等的可能。因此處理這些血清、血漿樣本時(shí)，應(yīng)該遵守
有關(guān)的安全操作規(guī)程，例如CDC/NIH 健康手冊(cè)：“微生物學(xué)和生物醫(yī)學(xué)試驗(yàn)中的安全”
/1984。
→ 避免硫酸和TMB 與皮膚接觸。如有接觸，可用水*沖洗。
→ 不可在使用試劑盒的地方吃飯、飲水、吸煙或化妝。
→ 不可用口吸取樣本。
操作要點(diǎn)/試驗(yàn)室質(zhì)量控制：
1、 使用前應(yīng)根據(jù)標(biāo)簽上指示冷藏。使用時(shí)所有試劑應(yīng)平衡至室溫。凍干標(biāo)準(zhǔn)品使用后
應(yīng)丟棄。
2、 取出所需的孔條后，立即密封包裝，以防變質(zhì)。
3、 不用時(shí)所有試劑要加蓋封好。
4、 不同批號(hào)的試劑不可混用。
5、 過(guò)期的試劑不可再用。
6、 使用干凈的吸頭來(lái)吸取各種試劑、標(biāo)準(zhǔn)品、對(duì)照或樣本，以防交叉污染。吸取硫酸
或底物溶液時(shí)，避免使用帶金屬部分的加樣器。
7、 用干凈的塑料容器配備洗滌液。
8、 使用前用振蕩器*混勻各種試劑。
9、 微孔內(nèi)殘留液須充分吸干或在吸水紙上拍干，吸水紙不可插入孔內(nèi)吸水。
10、 TMB溶液是光敏的，避免長(zhǎng)時(shí)光照。避免與金屬接觸產(chǎn)生顏色反應(yīng)。
警告：TMB 有毒，避免手直接接觸，并妥當(dāng)處理。
11、 如配制后幾分鐘產(chǎn)生深蘭色，表明TMB 溶液被污染，必須棄去。在檢測(cè)完成
后一小時(shí)內(nèi)必須讀結(jié)果。
12、 吸取樣本時(shí)，按順序逐孔加樣，以確保孵育時(shí)間相同。
13、 孵育時(shí)間見(jiàn)操作規(guī)程。
14、 在洗滌微孔板之后15 分鐘內(nèi)加入TMB 溶液。
樣品收集，處理和保存
1、 細(xì)胞培養(yǎng)上清液——1000xg 離心10 分鐘去除顆粒和聚合物。
2、 血清——操作過(guò)程中避免任何細(xì)胞刺激。使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管。收集血液
后，1000xg 離心10 分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離。
3、 血漿——EDTA，檸檬酸鹽和肝素血漿可用于檢測(cè)。1000Xg 離心30 分鐘去除顆粒。
4、 保存——如果樣品不直接使用，將其分為小部分（250-500ul）-70℃下保存，避免
反復(fù)冷凍。如果可能，不要使用溶血和高脂血。如果血清中有大量的顆粒，檢測(cè)前
先離心或過(guò)濾。
注意：不要在37℃或56℃加熱解凍。在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。
試劑準(zhǔn)備：
1、標(biāo)準(zhǔn)稀釋緩沖液
蒸餾水10 倍稀釋。
2、標(biāo)準(zhǔn)品
按標(biāo)簽要求以標(biāo)準(zhǔn)稀釋液配制，其濃度為3000pg/ml sCD95，可儲(chǔ)存。稀釋前輕輕
振蕩此標(biāo)準(zhǔn)品5 分鐘。每次實(shí)驗(yàn)前將此標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行系列稀釋?zhuān)荒鼙４妗?/div>
3、對(duì)照
按標(biāo)簽要求以標(biāo)準(zhǔn)稀釋液配制。加樣前輕輕振蕩對(duì)照5 分鐘。稀釋后不能儲(chǔ)存。
4、生物素標(biāo)記抗sCD95 的稀釋
生物素標(biāo)記抗sCD95 用生物素標(biāo)記抗體稀釋液根據(jù)使用微孔數(shù)在干凈玻璃管中
稀釋。試驗(yàn)時(shí)準(zhǔn)備。參見(jiàn)下表：
| 使用微孔數(shù) | 生物素標(biāo)記的抗體（ul） | 生物素標(biāo)記抗體稀釋液（ul） |
| 16 | 40 | 1060 |
| 24 | 60 | 1590 |
| 32 | 80 | 2120 |
| 48 | 120 | 3180 |
| 96 | 240 | 6360 |
5、 親和素HRP 的稀釋
在含5ul 親和素HRP 的瓶?jī)?nèi)加入0.5ml HRP 稀釋液。本液為一次性使用。
根據(jù)使用微孔數(shù)在干凈玻璃管中進(jìn)一步稀釋。參見(jiàn)下表：
| 使用微孔數(shù) | 親和素HRP（ul） | HRP 稀釋液（ml） |
| 16 | 30 | 2 |
| 24 | 45 | 3 |
| 32 | 60 | 4 |
| 48 | 75 | 5 |
| 96 | 150 | 10 |
6、 洗滌緩沖液的稀釋
蒸餾水200 倍稀釋。
檢測(cè)方法：
1、 試劑用前充分混勻，避免產(chǎn)生泡沫。
2、 確定需要的微孔數(shù)，所有樣本、標(biāo)準(zhǔn)品、空白和對(duì)照樣本均要做雙份。
3、 加100ul 配好的標(biāo)準(zhǔn)稀釋液至標(biāo)準(zhǔn)孔B1,B2,C1,C2,D1,D2,E1,E2,F1,F2。（配制見(jiàn)前
述）吸取200ul 標(biāo)準(zhǔn)品加入A1,A2。（見(jiàn)下表）從A1,A2 中吸取100ul 至B1,B2 孔內(nèi)；
反復(fù)吸排，使之混合。重復(fù)此步驟，從B1,B2 至C1,C2，然后從C1,C2 至D1,D2 等等。
sCD95 標(biāo)準(zhǔn)稀釋液濃度由3000 至93.75pg/ml。從zui后的F1,F2 孔內(nèi)吸取100ul 棄掉。
4、 加100ul 配好的標(biāo)準(zhǔn)稀釋液至空白孔G1,G2。
5、 加100ul 樣本至樣本孔和100ul 對(duì)照品至對(duì)照孔H1,H2。
6、 配制生物素標(biāo)記的抗sCD95。（配制見(jiàn)前述）
7、 加50ul 生物素標(biāo)記的抗sCD95 稀釋液于所有孔內(nèi)。
8、 蓋上微孔板，室溫下（18 至25℃）孵育1 小時(shí)。
9、 洗滌微孔板：① 吸去孔內(nèi)液
② 加0.3ml 洗滌液于各孔
③ 再吸去各孔內(nèi)液
④ 重復(fù)②和③二次
10、 僅在用前配制HRP 液。（配制見(jiàn)前述）
11、 加100ulHRP 液于各孔，含空白孔。加蓋。
12、 室溫下孵育0.5 小時(shí)。
13、 洗滌微孔板。（見(jiàn)步驟9）
14、 加100ulTMB 底物液至各孔。室溫下避光孵育20 至30 分鐘。
15、 通常根據(jù)ELISA 閱讀器確定孵育時(shí)間：許多ELISA 閱讀器僅讀數(shù)至2.0 O.D 值。
監(jiān)察O.D 值，應(yīng)在陽(yáng)性結(jié)果衰褪前終止反應(yīng)。（不超過(guò)20 分鐘）
16、 酶底物反應(yīng)用100ul 硫酸加入各孔內(nèi)終止。終止反應(yīng)后1 小時(shí)內(nèi)（這段時(shí)間在2
至8℃避光保存）或加入硫酸后立即讀取結(jié)果。
17、 用分光光度儀讀數(shù)，450nm 作為初始波長(zhǎng)，620nm（可以用610 至650nm）作為
參考波長(zhǎng)。
建議微孔板編碼：
| | 標(biāo)準(zhǔn)濃度（pg/ml） | 樣本孔 | ||||||||||
| | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| A | 3000 | 3000 | | | | | | | | | | |
| B | 1500 | 1500 | | | | | | | | | | |
| C | 750 | 750 | | | | | | | | | | |
| D | 375 | 375 | | | | | | | | | | |
| E | 187.5 | 187.5 | | | | | | | | | | |
| F | 93.75 | 93.75 | | | | | | | | | | |
| G | 空白 | 空白 | | | | | | | | | | |
| H | 對(duì)照 | 對(duì)照 | | | | | | | | | | |
結(jié)果分析：
制作一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，平均光吸收值作Y 軸，對(duì)應(yīng)的sCD95 濃度作X 軸。各樣本中的sCD95
含量可根據(jù)樣本O.D 值通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)確定。
本試驗(yàn)的局限性：
超過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍（3000pg/ml）時(shí)，不可推測(cè)結(jié)果；樣本必須稀釋后再檢測(cè)。
本試驗(yàn)的檢測(cè)特性：
1、 敏感性：zui小檢測(cè)濃度低于47pg/ml。
2、 準(zhǔn)確性：
| 批內(nèi) | 批間 | ||||||||
| 樣本 | N | 均值（pg/ml） | SD | CV% | 樣本 | N | 均值（pg/ml） | SD | CV % |
| A | 14 | 1719 | 106 | 6.1 | A | 8 | 1752 | 145 | 8.2 |
| B | 16 | 703 | 39 | 5.5 | B | 8 | 856 | 68 | 7.9 |
檢測(cè)程序小結(jié)： 總時(shí)間 = 1 小時(shí)45 分鐘
加100ul 樣本或配好的標(biāo)準(zhǔn)品或?qū)φ?/div>
加50ul 配好的生物素標(biāo)記的抗體于各孔內(nèi)
室溫孵育1 小時(shí)
洗3 次
加100ul 親和素-HRP 標(biāo)記物
室溫孵育0.5 小時(shí)
洗3 次
加100ul TMB，避光，顯色20 至30 分鐘
加100ul 硫酸，終止反應(yīng)
在450nm 處讀取吸光度
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注意: 請(qǐng)以原文說(shuō)明書(shū)為準(zhǔn)
