一、測(cè)定用乙醇固定的DNA的含量

1、培養(yǎng)細(xì)胞的DNA含量的測(cè)定

制備單細(xì)胞懸液于200μl的PBS緩沖液中；

加入2ml預(yù)冷的70%乙醇，4℃保存；

附:細(xì)胞固定的一般步驟

1) 取單細(xì)胞懸液1～2×10⁶個(gè)細(xì)胞于PBS（PH=7.2）緩沖液中；

2) 300g離心5分鐘，棄上清，反復(fù)兩次；

3) 重懸細(xì)胞于0.5ml PBS緩沖液中；

4) 將細(xì)胞懸液放置于2～3ml冷70%乙醇中，混勻，保存于4℃，至少30分鐘。在4℃條件下可保存2~3周。

注意：

² 根據(jù)實(shí)驗(yàn)的要求，固定劑也可選用1～3%多聚甲醛；

² 將乙醇作為固定劑時(shí)，乙醇應(yīng)預(yù)冷至0～4℃；

² 細(xì)胞在固定時(shí)，固定劑應(yīng)緩慢滴入細(xì)胞懸液中，使固定劑的濃度緩慢增加，并不斷震搖，以免細(xì)胞成團(tuán)（特別是用乙醇固定時(shí)）。

² 300g離心5分鐘，去上清，再重懸于400μl PBS中；

² 顯微鏡下觀察，若有明顯的黏附，須再用篩網(wǎng)過(guò)濾；

² 加入PI（含Rnase），避光孵育30分鐘；

² 上機(jī)檢測(cè)。

2、新鮮組織的DNA含量的測(cè)定

1) 用200mg濕重組織用機(jī)械法制成單細(xì)胞懸液；

2) 500g離心5分鐘；

3) 棄上清，重懸于10ml染色-去污劑中；

4) 再過(guò)濾，用200目的篩網(wǎng)或70~80μm的篩網(wǎng)過(guò)濾；

5) 上機(jī)檢測(cè)。

3、石蠟包埋組織切片的DNA含量的測(cè)定

1) 從石蠟包埋切取切片50 μm厚，2~3片，制成單細(xì)胞懸液；

2) 用PBS緩沖液洗滌，500g離心5分鐘，棄上清；

3) 加入PI液1ml室溫避光30分鐘；

4) 調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10⁶/ml；

5) 上機(jī)檢測(cè)。

二、細(xì)胞凋亡檢測(cè)及相關(guān)分子檢測(cè)

1、細(xì)胞DNA含量分布（由細(xì)胞DNA降解方式檢測(cè)細(xì)胞凋亡）

² 收集已固定的單細(xì)胞懸液約5×10⁵~1×10⁶/ml；

² 離心除去固定液，3ml PBS重懸細(xì)胞;

² 1500rpm離心，5分鐘 ，棄去PBS；

² 加PI染液1ml，室溫避光20分鐘；

² 調(diào)整細(xì)胞濃度5×10⁵/ml；

² 上機(jī)檢測(cè)。

2、磷脂酰絲氨酸外翻分析檢測(cè)細(xì)胞凋亡

1) 常規(guī)制備單細(xì)胞懸液,用PBS洗兩次.(若為全血要先溶 血),取約5×10⁶個(gè)細(xì)胞，1500rpm離心,棄上清,用400μl 1×Binding Buffer重懸；

2) 分成a、b、c、d、e五管，每管約1×10⁶個(gè)細(xì)胞

a) 陰性對(duì)照，不加任何試劑；

b) 陽(yáng)性對(duì)照,加2%多聚甲醛固定30分鐘,加AnnexinV 5μl,室溫10min,用1×Binding Buffer洗一次,棄上清再加190μl 緩沖液、10μl PI避光15分鐘

c) 加10μl PI，避光孵育15分鐘；

d) 加5μl AnnexinV液，室溫避光孵育15min；

e) 加10μl PI和5μl AnnexinV液，室溫避光孵育5min；

3) 每管各加400μl 1×Binding Buffer。

4) 上機(jī)檢測(cè)。

注意 a. 操作動(dòng)作要盡量輕柔，勿用力吹打細(xì)胞；

b. 操作時(shí)注意避光；

c. 反應(yīng)完畢后盡快檢測(cè)，在一小時(shí)內(nèi)檢測(cè)。

3、用單克隆抗體APO2.7檢測(cè)細(xì)胞凋亡

1) 放置0.5~1×10⁶個(gè)細(xì)胞到試管中；

2) 室溫離心200g，6min；

3) 棄上清，加入100μl冷的（4℃）在PBSF溶液中含100µg/ml的digitonnin，輕輕地重懸細(xì)胞，在冰上孵育20min；

4) 加入2ml冷的（4℃）PBSF液，室溫離心200g，6min；

5) 棄上清，加入20μl PE標(biāo)記的Apo2.7 單克隆抗體和80μl PBSF液，用vortex輕輕震蕩，室溫避光孵育15分鐘；

6) 加入2ml PBSF液，室溫離心200g，6min；

7) 棄上清，加入1ml PBSF液重懸細(xì)胞；

8) 避光保存，直到流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

PBSF：含2.5% FCS（v/v）和0.01%NaN3（w/v）的PBS。

三、用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行DNA周期分析

1、方法：同DNA含量檢測(cè)

2、注意：

單細(xì)胞濃度應(yīng)約10⁶/ml，以免影響檢測(cè)的CV值和檢測(cè)結(jié)果；

制備完成后的標(biāo)本應(yīng)用光學(xué)顯微鏡檢查其質(zhì)量（如細(xì)胞是否聚集或過(guò)多碎片），以保證得到足夠的細(xì)胞含量；

醛類固定會(huì)影響PI與核酸的結(jié)合。

四、免疫熒光標(biāo)記法

1、細(xì)胞膜上的免疫熒光檢測(cè)法

間接標(biāo)記法

1) 制備單細(xì)胞懸液；

2) 細(xì)胞計(jì)數(shù)，取出1×10⁶個(gè)細(xì)胞于試管中；

3) 用臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)活細(xì)胞數(shù)，要求活細(xì)胞數(shù) >90～95%；

4) 在試管中加入一抗，（劑量按照說(shuō)明書(shū)的要求），孵育30～60分鐘；

5) PBS洗滌1～2次，1500rpm，離心3分鐘，棄上清；

6) 加入二抗，孵育20～30分鐘；

7) PBS洗一次，1500rpm，離心3分鐘，棄上清;

8) 加300μl PBS，上機(jī)檢測(cè)(若不能及時(shí)上機(jī)檢測(cè)，可加1ml 1%多聚甲醛固定，可放置1周)。

直接標(biāo)記法

①～③同間接標(biāo)記法

④在試管中加入熒光標(biāo)記的抗體，混勻，孵育30分鐘；

⑤用PBS洗2次，1500rpm，離心3分鐘，棄上清;

⑥加300μl PBS(PH=7.4)，上機(jī)檢測(cè)。

2、 細(xì)胞膜內(nèi)的免疫熒光標(biāo)記法

間接免疫熒光標(biāo)記法

1) 取已制備好的單細(xì)胞懸液，用1～3%的多聚甲醛固定30分鐘（也可4℃保存Overnight）；

2) 用PBS洗兩次，棄上清；

3) 細(xì)胞膜打孔，加入0.1%皂素 200μl，室溫10分鐘；

4) 用PBS洗滌兩次；

5) 加入*抗體，室溫30～60分鐘，或4℃Overnight，同時(shí)須設(shè)陰性對(duì)照或同型對(duì)照管；

6) 用PBS洗滌兩次；

7) 加入二抗（熒光標(biāo)記的抗體）室溫20分鐘，避光；

8) 用PBS洗滌1～2次，棄上清；

9) 重懸細(xì)胞于500μlPBS中，上機(jī)檢測(cè)。

直接熒光標(biāo)記法

①～⑤同間接熒光標(biāo)記法；

加入熒光素標(biāo)記好的抗體，避光30分鐘（同時(shí)做同型對(duì)照管）；

用PBS洗滌１～２次，棄上清；

加300μl PBS上機(jī)檢測(cè)。

細(xì)胞膜上及細(xì)胞內(nèi)雙標(biāo)記法（直標(biāo)法）

1) 取出已制備好的未固定的單細(xì)胞懸液1×10 ⁶個(gè)細(xì)胞于試管中；

2) 用PBS洗滌兩次；

3) 加入用熒光素標(biāo)記的抗體來(lái)標(biāo)記細(xì)胞膜上的抗原，同時(shí)加上陰性對(duì)照管，室溫孵育20分鐘；

4) 在試管中加入1％～3％多聚甲醛1ml，固定30分鐘；

5) PBS洗滌兩次1500rpm 3分鐘，棄上清;

6) 打孔，加入0.1％皂素200μl室溫10分鐘;

7) 用PBS洗滌兩次，棄上清;

8) 加入用熒光素標(biāo)記的抗體，標(biāo)記膜內(nèi)的抗原（標(biāo)記膜內(nèi)的抗體的熒光素的顏色與膜上標(biāo)記的熒光素的顏色務(wù)必不相同）室溫20分鐘孵育;

9) 用PBS洗一遍棄上清；

10) 用300μlPBS重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測(cè)

五、流式細(xì)胞術(shù)中的幾點(diǎn)注意事項(xiàng)：

1、對(duì)照組的設(shè)置：

在流式細(xì)胞術(shù)中所測(cè)得的量都是相對(duì)值，不是值。如需知道值時(shí)必須設(shè)置對(duì)照組樣品。對(duì)照組樣品包括有陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照。

（1）、陰性對(duì)照的設(shè)置

² 在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，如做間接標(biāo)記法，可設(shè)置與一抗無(wú)關(guān)的實(shí)驗(yàn)，即在實(shí)驗(yàn)中不加一抗而只加上帶有熒光標(biāo)記的第二抗體作為陰性對(duì)照管，作為陰性對(duì)照。

² 在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，假設(shè)做直接標(biāo)記法，可設(shè)置理論上的陰性細(xì)胞作為陰性對(duì)照管，實(shí)驗(yàn)過(guò)程及步驟與實(shí)驗(yàn)組務(wù)必相同。（做間接標(biāo)記法時(shí)，同樣也可同時(shí)設(shè)置“陰性細(xì)胞”的陰性對(duì)照管作為陰性對(duì)照。

² 在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，假設(shè)做直接標(biāo)記法，可將實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，取一管，加上與實(shí)驗(yàn)抗體所標(biāo)記的熒光顏色相同的同型對(duì)照來(lái)作為陰性對(duì)照。

（2）、陽(yáng)性對(duì)照的設(shè)置：

在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中如涉及到表達(dá)缺失或減少的實(shí)驗(yàn)，應(yīng)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照組，其設(shè)置方法與陰性對(duì)照設(shè)置相同。

2、幾點(diǎn)建議：

1) 在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，在保證實(shí)驗(yàn)的科學(xué)性和準(zhǔn)確性的基礎(chǔ)上，應(yīng)盡量減少實(shí)驗(yàn)工序和過(guò)程。由于間接標(biāo)記法的工序多，實(shí)驗(yàn)過(guò)程長(zhǎng)，如再加之操作的不熟練，細(xì)胞更容易丟失和受損，而造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果的誤差。因此，在條件允許的范圍內(nèi)，建議盡量做直接標(biāo)記法而不去做間接標(biāo)記法，以保證實(shí)驗(yàn)的真實(shí)性和準(zhǔn)確性。

2) 建議送檢細(xì)胞一定要足夠量，一般要求1×10⁶個(gè)細(xì)胞。不要過(guò)少。因?yàn)?，如?xì)胞太少檢測(cè)時(shí)樣本流量相對(duì)會(huì)增大從而影響變異系數(shù)，結(jié)果也不可信。細(xì)胞量也不宜過(guò)多，因細(xì)胞量太多加入的抗體或染料相對(duì)不足，結(jié)果也由此受影響。

3) 同一種細(xì)胞需同時(shí)做雙標(biāo)記時(shí)，須做雙標(biāo)記的同型對(duì)照，且兩種抗體所標(biāo)記的熒光顏色務(wù)必不同。